愈心痛对犬缺血心肌细胞线粒体超微结构损伤保护作用的体视学研究
学术成果
摘要
目的：本实验在结扎麻醉犬冠状动脉左前降支中段造成急性心肌缺血的模型上，动态检测了犬血清肌酸磷酸激酶（CPK）活性变化，并运用电镜技术和体视学研究方法对缺血心肌细胞线粒体的超微结构损伤进行了形态定量分析，以探讨具有益气活血功效的中药复方愈心痛胶囊对急性心肌缺血的保护作用。
方法：选用健康成年犬 20 只，随机分为空白对照组、阳性药对照组、愈心痛胶囊低剂量组和高剂量组。结扎冠脉建立心肌缺血模型，动态监测血清 CPK 活性，3 小时后取心肌组织进行透射电镜观察和体视学定量分析。
结果：心肌酶检测显示：心肌缺血时间越长，血清 CPK 活性越高，而愈心痛可阻止缺血心肌 CPK 的漏出，使其活性显著低于生理盐水对照组；电镜体视学研究表明：缺血心肌细胞线粒体的体密度（Vv）明显增加，面数密度（NA）和比表面（δ）却降低，提示线粒体高度水肿，而给予愈心痛后可显著降低缺血心肌线粒体的 Vv，同时增加 NA 和δ。
结论：愈心痛胶囊可减轻缺血造成的心肌线粒体水肿，阻止缺血心肌膜损伤，有稳膜作用，在一定程度上维持膜结构的完整性，从而保护心肌超微结构，防治心肌缺血性损伤。提示愈心痛胶囊对缺血性心脏病的治疗具有潜在的临床应用价值。
关键词
愈心痛胶囊；心肌缺血；线粒体；体视学研究
研究背景
线粒体不仅是细胞内产生能量的主要场所，而且是维持细胞内环境稳定的重要细胞器，因此，线粒体结构和功能的正常是细胞生存的基本条件。在异常生理、病理条件下，线粒体也是最敏感的细胞器之一，因而成为进行超微结构生理、病理研究的较理想的指标之一。
近年来，体视学研究方法已逐步应用于生物医学领域，对组织和细胞进行原位定量分析，从而使定性、定位、定量同步化研究成为可能。本研究通过体视学方法，从亚细胞水平探讨愈心痛胶囊对缺血心肌的保护作用。
材料和方法
1. 实验药物
愈心痛胶囊主要成分为红参、三七，其提取干粉由吉林敖东制药厂提供；硫氮卓酮，30mg/片，上海延安制药厂生产；0.9％氯化钠注射液，石家庄市第四制药厂生产。
2. 模型建立及标本制备
选用健康成年犬 20 只，雌雄不限，体重 13.85±1.96kg，由中国中医研究院西苑医院动物室提供。随机分为：
- 空白对照组 5 只，生理盐水 3ml/kg
- 阳性药对照组 5 只，硫氮卓酮 5mg/kg
- 愈心痛胶囊低剂量组 5 只，1g 生药/kg
- 愈心痛胶囊高剂量组 5 只，2g 生药/kg
采用结扎麻醉犬冠脉左前降支中段的方式，复制心肌缺血病理模型，结扎冠脉 15 分钟后，各组经十二指肠给予实验药物和生理盐水，分别于冠脉结扎后 15 分钟（药前）、药后 60、120、180 分钟抽取股静脉血各 2ml，分离血清，测血清 CPK 活性。结扎后 3 小时，迅速取下心脏，在左心室第三片标本的缺血中心区和非缺血区取材，按透射电镜制片常规脱水、包埋、切片，JEM－100CX 型透射电镜观察与摄片。
3. 体视学研究方法
采用体视学中体密度（Vv）、面数密度（NA）和比表面（δ）3 个指标对心肌细胞线粒体进行形态定量测算，运用点计数法（Point Counting Method）。
体密度 (Vv)：指某一细胞结构成分的总体积与它所在的参照系总体积之比，其数值可从每张照片上落在某种结构内的测试点数目与同一张照片落在参照系截面内的测试点数目之比求得。
面数密度 (NA)：是指参照系截面的单位面积内某种颗粒截面的数目。
比表面 (δ)：是指某种结构本身单位体积所具有的表面积，它只与结构本身有关，而与原来的参照系无关。
研究结果
1. 对血清 CPK 活性的影响
血清 CPK 活性随着冠脉结扎时间的延长逐渐增高，以结扎 15 分钟时（给药前）测量值为对照，生理盐水组给药后 60、120、180 分钟分别增加 34.56％、83.30％（P<0.01）及 149.18％（P<0.001），说明心肌有急性损伤；而愈心痛两个剂量组及硫氮卓酮组均能明显抑制 CPK 的漏出，使其活性显著低于盐水对照组，表明心肌损伤程度较轻。
2. 心肌超微结构的变化
电镜下可见，非缺血区心肌细胞结构正常，肌原纤维明暗带清晰，线粒体丰富饱满，基质均匀致密，嵴排列整齐；生理盐水组肌原纤维大量溶解，肌丝松散，线粒体部分肿胀，部分收缩，嵴扭曲变形，少数断裂，属不可逆性损伤；高剂量愈心痛组心肌组织的损伤明显轻于生理盐水组，肌原纤维排列较规则，线粒体结构尚完整，部分线粒体稍肿胀，嵴大部分清楚，属可逆性损伤。
3. 心肌线粒体的定量分析
从体视学研究来看，结扎犬冠状动脉左前降支后，缺血区心肌细胞线粒体的 Vv 明显增加（25.23±4.82%），而 NA（0.108±0.043μm⁻²）、δ（3.46±1.28μm⁻¹）却降低，与非缺血区心肌相比，有非常显著的差异（P<0.001），示线粒体肿胀严重。
各用药组心肌线粒体 Vv 也呈增高趋势，而 NA、δ减少，但其变化幅度较生理盐水组明显减轻，组间差异 P<0.05～0.01，示线粒体水肿较轻。愈心痛高剂量组 Vv 为 19.53±4.80%，NA 为 0.185±0.085μm⁻²，δ为 4.40±1.34μm⁻¹，效果优于低剂量组和硫氮卓酮组。
讨论
本实验发现，在遭受缺血事件后，心肌线粒体等超微结构严重受损，其体密度明显增大，而面数密度比表面显著减少，表面线粒体高度水肿且数量减少，线粒体膜及基本结构发生病变。从体视学测量结果来看，生理盐水组 Vv 最大，NA、δ最小，提示此组线粒体水肿最严重，超微结构的破坏也以生理盐水组最重。
各用药组较生理盐水组 Vv 减少，NA、δ增大，心肌损伤程度也较轻，说明各用药组均有减轻缺血造成的线粒体水肿的作用，尤以愈心痛高剂量组作用明显。
细胞膜和亚细胞膜的完整是维持细胞功能的重要前提。最近认为，生物膜损伤是心肌细胞由可逆性损伤转化为不可逆损伤的早期特征和重要环节。因此，阻止心肌缺血时线粒体膜的损伤具有重要意义。本研究通过动态监测心肌缺血犬 CPK 水平，发现愈心痛可抑制缺血心肌 CPK 的漏出，对生物膜有稳定作用，在一定程度上维持膜结构的完整性。
这种保护作用的机理可能与该方益气活血功能和阻止心肌缺血时的膜损伤的作用有关。本研究为愈心痛胶囊抗心肌缺血的药理作用提供了亚细胞水平的形态学依据；定性与定量，结构与功能相结合地研究中药作用机理，也是中西医结合研究方法的一种有益尝试。
参考文献
[1] 体视学研究方法参考文献略
[2] 生物膜损伤与心肌缺血相关研究参考文献略